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逆相・順相、イオン交換等のカラム



10.逆相カラム
 10−1.ODSカラム
 10−2.その他のシリカカラム
 10−3.ポリマーカラム
11.順相カラム
 11−1.シリカカラム
 11−2.ポリマーカラム
12.逆相・順相カラムのまとめ
13.イオン交換カラム
14.配位子交換カラム
15.イオン排除カラム


10.逆相カラム
 

10−1.ODSカラム
 分離モード逆相モードを用いるカラムのことを逆相カラムといいます。逆相モードに用いるゲルの場合には、シリカゲルを基材としてこれに官能基とよばれるものを結合したものを使います。飲み屋横町の場合でいえば、飲み屋が並んでいるだけでもよいのですが、客引きが出ていれば更に効果的に客を呼び込むことができます。この客引きに相当するものが官能基であり、官能基の中で最もよく用いられるものがオクタデシル基というものです。
 オクタデシル基とは炭素が18個つながったもので、化学式で表せば次のようになります。

  H H H H H H H H H H H H H H H H H H 
  | | | | | | | | | | | | | | | | | | 
 −C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−C−H
  | | | | | | | | | | | | | | | | | | 
  H H H H H H H H H H H H H H H H H H 

 ここで、Cは炭素、Hは水素を表します。同じことをもう少し簡単に表すと次のように表すことができます。
 -CHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCH3
 また、オクタデシル基という代わりに、Cが18個あることからC18基ということもあります。(そもそも、オクタデシルというのは18のことで、8を表すoctaと、10を表すdeciからできた用語です。)
 このような、炭素と水素からできた鎖がシリカゲルの表面に無数についています。上のような式で表すとかなり長い鎖のようにも思えますが、シリカゲルの粒径に比べれば十分に小さいので、1つのシリカゲルに無数の鎖がつくことができます。この鎖は、シリカゲルの孔の中の表面にもついています。
 「飲み屋横町」の場合は、人によって客引きにまとわりつかれた時に、客引きを全く相手にしない人と、客引きに誘われて店に入る人に分かれます。試料がインジェクターから注入されカラムに入った時にも、鎖と各成分との相互関係により、カラムから出てくる時間が成分毎に異なります。これをもう少し化学的な言葉で言えば、「ゲルとサンプル中の成分の間の親和力により分離が行われる」ということができます。この親和力は分配または吸着といわれ、このような分離モードを分配・吸着モードと呼ぶこともあります。正確には、分配・吸着モードのうちの一つが逆相モードです。
 シリカゲルを基材として、これにオクタデシル基を結合したゲルのことを、ODS(OctaDecyl Silica)ゲルと呼びます。また、ODSゲルを充てんしたカラムをODSカラムといいます。(C18カラムということもありますが、ODSカラムの方が一般的です。)シリカカラムのうちでは、ODSカラムの割合が圧倒的に多く、シリカカラムの約80%はODSカラムです。
 ODSカラムの場合、C18基が結合できるところにすべてにC18基がつけば良いのですが、実際にはC18基がつかないまま残された部分があり、これを残存シラノール基といいます。残存シラノール基をそのまま放置すると分離に影響を与えますので、エンドキャッピングという処理を行って残存シラノール基が働かないようにすることがあります。エンドキャッピングしたゲルは一般的には高品質であり、現在ではエンドキャッピングしたゲルが主流となっています。しかし、試料の種類によっては、残存シラノール基があった方がかえって良い結果を生む場合もあり、この辺がHPLCの難しいところです。

10−2.その他のシリカカラム

 逆相カラムでは、ODSカラムが最も一般的ですが、C18基は鎖の長さが長いので、効率が良すぎてカラムの中にサンプル中の成分が長く留まりすぎ、測定時間が長くかかりすぎることがあります。いってみれば、客引きがうまく客を店に引き込みすぎて、客が店に入り込んだままなかなか出てこないというような状況になる場合があります。うまく分離ができても、測定時間があまりにも長すぎては実用的ではありませんので、このような場合は鎖の長さのもっと少ない官能基をつけたものを用いた方が効果的です。そのような官能基としては次のようなものがあります。
  C8:オクチル基  -CHCHCHCHCHCHCHCH3
  C4:ブチル基   -CHCHCHCH
  C3:トリメチル基 -CHCHCH
また、このほかにフェニル基、シアノプロピル基などが結合されたシリカゲルを充てんしたカラムもあります。

10−3.ポリマーカラム

 上にも述べたように、逆相用カラムとしてはODSカラムが圧倒的に使用されていますが、最近ではポリマー系のカラムも用いられるようになってきました。
 一般的にポリマーカラムの特長とされている点は次の通りです。
1)寿命が長い:ポリマーゲルはシリカゲルに比べて安定で劣化が少ないといえます。使用の頻度にもよりますが、シリカカラムでは3ケ月程度で交換するのが一般的ですが、ポリマーカラムでは1年以上使用できることもめずらしくありません。
2)再現性が良い:シリカゲルは製造ロット毎にかなり品質がばらつきますが、ポリマーゲルはシリカゲルに比較して製造工程をコントロールすることが容易であり、品質のばらつきが少ないことが特長です。ユーザーの立場としては、カラムを買い替えた場合に、以前のカラムと全く同じ測定結果を得ることを期待していますので、ロット毎の品質のばらつきの少ないカラムを要望しているといえます。
3)アルカリで使える:シリカカラムは、アルカリ性の溶離液では使用できません。塩基性医薬など試料によってはアルカリ性溶離液を使用しないとうまく分離できないものもあり、このような試料の分離にはポリマーカラムが有効です。 また、カラムの中に異物がたまって、そのためにカラムが使用できなくなることがあります。シリカカラムでは廃棄するしかない場合でも、ポリマーカラムの場合ですとアルカリ性の溶液で洗浄して異物を取り除き再生できることがあります。
4)一般的には、シリカカラムに比べてポリマーカラムの分離性能はやや劣るといわれています。これを頑なに信じてポリマーカラムは使いものにならないと頭から考えられているユーザーの方もおいでのようです。
5)一般的に、シリカカラムに比べてポリマーカラムは高価格といえます。
 ポリマーカラムには1)〜3)にあげたような利点があるにもかかわらず、シリカカラムに比べてあまり多くは使用されていないのが実情です。5)の価格の点についていえば、ポリマーカラムの価格も徐々に低下してきており、1)で説明した寿命の点を考えれば決して高価格とはいえません。一番の問題は4)の分離性能の点ですが、最近のポリマーカラムの性能は向上しており、性能的にシリカカラムに近づいており、シリカカラムと比べて遜色ないものになってきているといえます。
 Shodexでは逆相ポリマーカラムに力を入れて開発を行っています。Shodexのポリマーカラムのうち最も広く使われているカラムは、ODPカラムです。これは、ポリマーゲルにオクタデシル基を結合させたものでOctaDecyl Polymer の略です。このネーミングはODSカラムのユーザーには、シリカのSがポリマーのPに変っただけなので、理解し易く非常に親しみやすいものといえます。
 Shodexの逆相ポリマーカラムで次によく使われているのがDE−413です。このカラムはポリメタクリレートというポリマーゲルが基材で、これまでの逆相用のゲルと違って官能基がついていないゲルを用いている点が特長です。官能基がないので分離が悪いのではないかと思うとさにあらずで、なかなか良いカラムであるといえます。ODPとDE−413のどちらを使うべきかは試料の種類によりますが、DE−413の方がやや利用範囲が広いようです。

11.順相カラム

11−1.シリカカラム

 逆相カラムに続いて、順相カラムについて説明します。逆相と順相を厳密に説明するのは化学的に難しくなりますので、ごく概念的に簡単に説明します。
 液クロに用いられる溶液やゲルには極性の大小があります。水と油はまざり合わないものの代表的な例としてあげられますが、水のようなものを極性が大きいといい、油のようなものを極性が小さいといいます。官能基のつかないシリカゲルそのものは極性が大きいのですが、C18基がつくと極性が小さくなります。油は炭化水素といってCとHとでできており、このようなものは極性が小さくなります。ODSの場合はシリカがオクタデシル基で覆われていますので極性が小さくなっています。一方、水はO(酸素)とHでできており、このようなものは極性が大きくなります。シリカそのものはSiOですが表面のOにはHがついていますので、官能基のつかないシリカゲルは極性が大きいといえます。
 逆相モードとは、ゲルに極性の小さいもの(ODSゲルなど)を使って、溶離液には極性の大きいもの(水やアセトニトリルなど)を使うものであり。順相モードとは、ゲルに極性の大きいもの(シリカゲルなど)を使って、溶離液には極性の小さいもの(ヘキサン、クロロホルムなど)を使うものです。
 また、極性が大きい小さいという言い方の他に、親水性・疎水性という言い方もHPLCではよく使われます。水に溶け易いものつまり極性の大きいものを親水性といい、油に溶け易いものつまり極性の小さいものを疎水性といいます。
 液クロの初期の時代には、オクタデシル基のような官能基を結合したシリカゲルはまだ開発されていませんでしたので、官能基のつかないシリカゲルそのものをカラムに詰めて使用していました。つまり、歴史的には順相モードの方が先に使われていた訳で、この方法に「順相」という名前がつけられ、後から開発された逆相モードに従来のやり方とは逆の原理を使っているという意味で「逆相」という名称がつけられました。
 現在では逆相モードの方が圧倒的に多く使われており、現時点の基準では、逆相モードの方が一般的な方法で、順相モードの方が一般的な方法と逆の方法といえますが、歴史の順序を覆すことはできず、逆相・順相という言い方が定着しています。
 順相モードに使われるゲルには、官能基のつかないシリカゲルそのものの他、官能基としてアミノプロピル基(NH2基)を結合したシリカゲルなどがあります。アミノプロピル基を結合したカラムはアミノカラムとも呼ばれ、糖類の分析などの順相モードでの分析に広く用いられています

11−2.ポリマーカラム

 Shodexでは順相ポリマーカラムとして、ポリマーにアミノ基を結合したゲルを充てんしたNH2Pカラムを用意しています。アミノ基を表すNH2とポリマーのPを組み合わせたもので、シリカのアミノカラムに親しんだユーザーには覚え易いネーミングといえます。
 この他のShodexの順相カラムにはDC−613カラムがあります。ポリマーゲルにスルホ基を結合したゲルを充てんしたカラムで同じく順相モードで使用できます。
 NH2P、DC−613共に、シリカのアミノカラムと同様に順相モードでの糖類などの分析に用いられます。
 シリカカラムと比較したポリマーカラムの特長は、逆相カラムの場合と同様で寿命の長いこと、アルカリで使用可能なこと、再現性の良さなどがあげられます。

12.逆相・順相カラムのまとめ
 

 逆相・順相のカラムを総称して、分配・吸着カラムと呼ぶことは前に説明しましたが、カラムの性質・選択方法を理解するのには(図−8)が便利です。

(図−8)

 図の横軸はゲルの極性で右にいくほど極性が小さくなります。つまり、右の方にあるゲルは逆相モードで使用されるゲルで、左の方にあるゲルは順相モードで使用されるゲルといえます。中間のゲルは場合によって逆相でも順相でも使用できます。
 図の縦軸はゲルの細孔径(ポアサイズ)で、試料の大きさ(分子量といいます)によって、大きい試料には細孔径の大きいゲルを、小さい試料には細孔径の小さいゲルを用います。例えば、タンパク質は分子量の大きいサンプルですので細孔径の大きいゲルを使います。

13.イオン交換カラム
 

 磁石でNとSとを近づけるとくっつき、NとNまたはSとSとを近づけると反発するということはご存知と思います。電気の場合も同じようなことが起こります。+(プラス)の電気をもったものと−(マイナス)の電気をもったものは引き合い、+と+または−と−は反発し合います。
 化学物質はイオンという形のものになると電気を帯びることになります。+のイオンを陽イオン、−のイオンを陰イオンといいます。
 イオン交換モードでは、このイオンの引き合う力、反発し合う力をを利用して分離を行います。磁石の場合とイオンの場合とで違うのは、磁石のNはいつでもNで、SはいつでもSですが、物質がイオン化して溶液中にある場合には、同じ物質が回りの溶液との関係で、陽イオンになったり陰イオンなったり変化します。そこで、溶離液の電気的性質を徐々に変化させていきますと、サンプル中の各成分の電気的な強さはそれぞれ異なりますので、溶離液の性質の変化に伴って各成分が陽イオンから陰イオン(またはその逆)へと変化して、ゲルと引き合っていたものが反発し合うというように変化します。ゲルと反発し合うようになった成分はカラムから出てきますので、各成分イオンの電気的強さの順にカラムから溶出して分離されます。
 このように、イオン交換モードでは溶離液を徐々に変化させて分析を行うのが普通であり、このように溶離液の性質を徐々に変化させる方法をグラジエントといいます。グラジエントを行う場合には、2つの溶液を用いてその混合割合を時間と共に変化させる方法が最も多く用いられています。グラジエントを行うにはグラジエント用の溶離液混合装置を使用します。また、最近のポンプにはグラジエントの機能が内蔵されているものもあります。
 グラジエントに対して、一般の場合に用いられる溶離液を変化させない方法をアイソクラティックということもあります。
 イオン交換カラムのゲルとしては、ゲルに陽イオンまたは陰イオンの官能基を結合したものを用います。よく使われる官能基には次のようなものがあります。
   QA基:   第4級アンモニウム基  強陰イオン交換基
   DEAE基: ジエチルアミノエチル基 弱陰イオン交換基
   SP基:   スルホプロピル基    強陽イオン交換基
   CM基:   カルボキシルメチル基  弱陽イオン交換基
また、先に述べたように充てん剤用のゲルとしては、ゲルに孔の開いたポーラスゲルを使用しますが、イオン交換の場合には粒径の小さい(2.0〜2.5μm )孔の開いていないゲルを使用することがあります。この孔の開いていないゲルのことをノンポーラスゲルといいます。ノンポーラスゲルは高速分析(短時間分析)に威力を発揮します。
 イオン交換カラムにもポリマーカラムと、シリカカラムの両方があります。ただし、逆相カラムの場合のようにシリカカラムが圧倒的に多く用いられている訳ではなく、ポリマーとシリカと半々位に使用されているのではないかと思われます。イオン交換カラムは、タンパク質、核酸等の生化学関連分野で多く用いられています。

14.配位子交換カラム
 

 配位子交換カラムの場合は、イオン性の官能基を結合したゲルを使用していますが、官能基の先端に金属イオンが有るのが特長です。この金属イオンのことを対イオン(またはカウンターイオン)といいます。
 配位子モードは、主に糖類の分離に用いられますが、+の電気を帯びた(陽イオン化した)金属イオンと、−の電気を帯びた試料中のOHイオン(OとHが結合した陰イオン)との引き合う力を利用して分離を行います。試料中のOHイオンの数や、OHイオンの位置関係がサンプル中の各成分で異なることを利用して分離を行います。
 対イオンとしては、水素(H)、カルシウム(Ca2+)、鉛(Pb2+)、亜鉛(Zn2+)、ナトリウム(Na)などが用いられます。また、配位子交換モードだけで分離が行われる訳でなく、分配・吸着モードやこれから説明するイオン排除モードやサイズ分離モードとの組み合わせで分離が行われます。
 配位子交換カラムは糖類の分析などに用いられます。

15.イオン排除カラム
 

 イオン交換カラムの場合は、陽イオンと陰イオンの引き合う力を利用して分離を行いますが、イオン排除モードの場合はゲルと試料中の各成分の陰イオン同士の反発し合う力を利用します。
 イオン排除モードは単独では用いられず、分配・吸着モードなどと組み合わせることにより、分配・吸着モードでのカラム内に成分を留める力と、イオン排除モードでの反発し合う力によりカラムから出ようとする力のバランスによって分離を行います。
 イオン排除モードは、有機酸などの分析に用いられます。